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编辑|冷紫葉
目前对于肠道菌群的调节尚无科学有效的手段，有研究认为钻叶琳或能调节肠道菌群。钻叶琳是所有含咕琳环的化合物的总称，包含各种形式的维生素B12及其类似物。超过76%的人体肠道微生物需要使用钻叶琳，但只有不到25%的微生物具有合成钻叶琳的基因。
因此，肠道菌间存在复杂的对钻叶琳的竞争交流机制。但不同的钻叶琳究竟会对人体肠道菌群产生何种影响，其又是如何改变肠道菌群的，我们不得而知。
本实验摈弃了传统的动物模型，采用体外人体肠道模拟模型，然而该模型仍存在培养基无统一标准、【我.爱.线.报.网.】检测方法繁琐昂贵、数据返还周期长等缺点。
首先用科学的方法获得和处理了粪便。紧接着是培养基的优化，基于目前用于体外模拟发酵的培养基尚无统一的标准，即使同一发酵模型也存在实验不同培养基的情况，本课题综合了文献和专利中体外发酵的培养基成分的差别，设计了7因素2水平的正交实验，得
到了短期粪便菌扩培培养基体系，得到了发酵结果的菌门和菌属分别与人体粪便
最为接近的培养基配方以及菌密度上升最快的配方。
其次是发酵的气体环境的优化，目前体外肠道发酵主要是采用的是向发酵罐内通入氮气的方式以维持厌氧环境，也有少量研究报道采用COZ气体，但我们知道人体肠道环境的气体组成并非是纯氮气或纯CO:气体，因此我们采用不同比例的【我.爱.线.报.网.】以上气体混合进行发酵，研究气体对体外发酵的影响并试图找出最佳气体组合。
第三，是对检测方法进行了优化。传统的细菌纯培养存在耗时长、敏感度低等缺点、RC-RCR电泳指纹图谱只能在一定程度上反映菌群结构特征，荧光定量PCR虽能对微生物进行定量但只能针对扩增的目的菌株，而16S rRNA虽然可以快速、准确地对整个肠道微生物群落进行检测，但其计算量大、价格高，目前16S rRNA测序服务的市场价在300元/样左右。且以上检测方法至快也要2天，慢则需要一个月才能得到结果。基于目前体外模拟系统发酵液的检测方法的局限性，本课题尝试开发用气味指纹传感器Smin内快速反映肠道菌落的结构特征，并将气味指纹传感器的响【我.爱.线.报.网.】应结果对应16S rRNA的测序结果进行分析，以验证该快速检测方法的可行性。
最后，本课题对固定化发酵方法进行了优化，尝试模拟得到人体粘膜层菌群。目前体外模拟发酵几乎采用的都是细菌悬浮发酵。但是这种发酵方法会影响整个发酵器内生态系统的稳定性，不利于竞争力弱的细菌生存，并且容易造成污染。目前仅有的文献是采用两相法制备固定化细菌进行发酵，即将凝胶溶液与油相搅拌混合，然后分离洗涤。但该种方法不易操作，难以将油相洗涤干净，且其制作配方有待优化。
在绪论第一节中曾提到过膜菌群和腔菌群，肠道中茹膜层的菌群结构其实和腔菌群存在很大差异，例如乳酸菌这一茹膜层优势菌，主要定植在肠道茹膜上，却不是腔内优势菌。而普通的【我.爱.线.报.网.】悬浮发酵作为一个均匀的发酵环境，主要是模拟腔内环境，却忽略了真实肠道中靠近肠茹膜的茹膜环境。茹膜环境中含有大量由肠勃膜上皮细胞分泌的粘液素，可以避免被粘附微生物冲走(如:乳酸菌、双歧杆菌等)。此外，茹膜环境的另一特点是低剪应力，能极大地激活微生物基因表达。
本课题在前人研究基础上，提出用加入粘液素的凝胶小球来模拟肠道茹膜层环境，还原一直被忽略的肠道菌群“半数子民”一一戮膜层菌群，同时优化了固定化发酵技术。在更细致、更准确的同时也能更方便地体外模拟人体肠道微生物的组成，让体外肠道模拟发酵系统与真实肠道更为接近。
本章框架图如下:
实验材料及仪器
菌株和培养基
菌种
GFP荧光标记大肠杆菌(GFP Esche【我.爱.线.报.网.】richia coli实验室保藏菌株)。
培养签
LB液体培养基:称取该培养基粉末25 g于1L蒸馏水中粪便菌提取液制备本实验粪便由4名青年捐献，他们在研究人员阐明参与本次实验的利弊关系后志愿提供粪便，且已签署志愿者知情同意书。
粪便采集需在供体排尿后进行，以避免得到尿液和粪便样本棍合发酵的结果。首先在一个无人打扰的空间，随后将粪便收集器放在供体的座位下。收集好后立即将粪便样品转移到厌氧工作站中，以避免粪便中严格厌氧菌的死亡。
在无菌的厌氧工作站中，用药匙挖取每条粪便样品的中间部分，在电子天平上每份粪便样品称取Sg，混合后，在厌氧工作站中将每lOg粪便溶解于80 mL的PBS缓冲液，并以600 r/m【我.爱.线.报.网.】in的速度离心1 min,去除大部分固体颗粒，得到粪便细菌提取液。
实验仪器
正交实验设计探究静态发酵最佳培养基成分
正交实验设计
对比文献和专利中体外肠道模拟发酵的培养基成分差别，对无机盐、胆盐、
果胶、淀粉、葡萄糖、胰酶、粘液素这7个因素进行优化，设计正交实验，共得
到8组实验，如表2-3。
静态发酵
使用8:个容量为500ml的蓝盖瓶，分别加入200ml的对应的培养基，每个瓶中接种10mL的粪便菌提取，通氮气5分钟后盖紧盖子，放置于37℃恒温振荡培养箱振荡培养48 h，每24 h进行一次取样并测定样品OD600吸光值，整个接种取样过程在无菌的厌氧工作站中进行并平行三次。
DNA提取和16S rRNA测序
每【我.爱.线.报.网.】个样品取1.5 mL，使用TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取样品中的细菌基因组DNA，溶于100 pL的缓冲液TE中。DNA提取物用nanodrop-2000超微量核酸蛋白测定仪进行质量和浓度检测，检测合格后送到杭州联川生物有限公司进行16S rRNA测序。选取的扩增区域为rRNA基因的V3和V4可变区，测序平台为Miseqo Miseq测序完成后，得到原始的下机数据，利用overlap将双端数据进行拼接，并进行质控、嵌合体过滤，获得最终的有效数据。
对最终获得有效数据进行97%的相似度聚类为OTU(操作分类单元)，每个OTU对应于一条不同的16S rRNA序列(代表序列)，过滤【我.爱.线.报.网.】singleton序列以降低假阳性率，获得最终的OTU丰度及代表序列。根据每个OTU代表序列与16S rRNA数据库(RDP和NT-16S )比对结果，对OTU进行物种分类统计，获得不同分类水平(界门纲目科属种)物种丰度表。
体外发酵气体环境优化
搭建五组体外模拟单相发酵系统。每个发酵罐内的初始内容物由5%的粪便菌悬液和90%培养基组成。培养基的成分如下(g/L ):蛋白陈3.0;玉米淀粉8.0;酵母提取物4.5 ;胰蛋白膝3.0;粘液素0.5; L一半肤氨酸盐酸盐0.8; 3号胆盐0.4:血红素0.05;氯化钠4.5:吐温80 1.0;氯化钾2.5;磷酸二氢钾0.4;六水氯化镁4.5;六水氯化钙【我.爱.线.报.网.】0.2;七水硫酸镁3.0;七水硫酸亚铁0.1;二水氯化钙0.1;四水氯化锰0.32;七水硫酸钻0.18;五水硫酸铜 0.01;七水硫酸锌0.18;六水氯化镍0.092。每个发酵罐的初始发酵体积为300 mL，接种15 mL的粪便菌悬液后，先进行24h的批式发酵以稳定菌群。24 h后启动连续发酵，即以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出废液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵，流速为12.5 mL/h 。
整个体外模拟发酵过程持续7天，搅拌转子转速为120 r/min以维持均匀发酵，依靠加热冷凝系统保持发酵温度恒定在37 0C，依靠pH自动控制系统补充0.5 mol/L的NaOH【我.爱.线.报.网.】溶液和稀HC1来调节发酵pH使之稳定在6.8左右。
五个发酵罐内分别通100% Nz, 80% Nz和20% COz混合气、50% Nz和50% COz混合气、20% Nz和800fo COz混合气、100% CO:以保持发酵罐内的厌氧环境。每晚收集发酵液样品低温保存，待测定。整个气体环境优化实验重复三次。将收集到的样品筛选后按照2.3 .1.4进行DNA提取和16S rRNA测序分析。
电子鼻测气体成分
将上述实验收集到的发酵液样品各取15 mL，分别装于250 mL的锥形瓶中，并覆上保鲜膜进行封口，用水浴锅40℃水浴5 min进行预热处理，使气味物质得以挥发。随后采用顶空抽样的方法对样品进行气味【我.爱.线.报.网.】指纹测定。预试验后确定最佳实验参数为清洗时间:120 s.测定时间:75 s，洗涤气体:标准空气。由SmartNose软件每秒采样十次，测量结束后保存各个传感器的数据。
本实验所用电子鼻为实验室自主研发，是由14个传感器组成的阵列设备，每个传感器所能采集到的气味物质种类如下表。
固定化发酵技术优化
固定化粪便”凝胶小球制备及细菌固定率、死亡率评价
称取1g结冷胶和1.2g瓜儿豆胶，溶解于1 OOmL蒸馏水中，得到凝胶溶液，进行121 0C高压蒸汽灭菌15分钟。
待凝胶溶液冷却到40℃时，加入0.3g粘液素搅拌均匀，随后接种1 ml粪便细菌提取液，混合均匀后滴入模具(如图I)中凝固成型，得到直径约2cm的【我.爱.线.报.网.】球形或近球形的微生物凝胶珠。在1%的氯化钙溶液中浸泡20分钟进行硬化，将硬化的凝胶珠从氯化钙溶液中取出，用去离子水清洗，即得到“固定化粪便”凝胶小球，整个过程在无氧环境中进行。
将10g“固定化粪便”凝胶小球破碎并溶解于100 mL浓度为0.5%的EDTA
溶液中，用血球计数板在显微镜下进行细菌计数，并与稀释相同浓度的粪便细菌
提取液进行比较，得到细菌固定率。
取上述溶解了“固定化粪便细菌”的EDTA溶液100 uL，在细菌总数显色
培养基上涂布，用封口膜进行封口，再在37℃培养箱中培养培养48 h后进行平
板菌落计数，在相同条件下对稀释相同倍数的粪便提取液同样进行活菌计数操
作，得到“固定化粪便细菌”的死【我.爱.线.报.网.】亡率。
菌门最优培养基
各实验组发酵48小时后取样提取细菌DNA，进行16S rRNA测序，共得到
6个门，分别为厚壁菌门、放线菌门、变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门等。将得
到的菌门结果与原始粪便细菌提取液样品中的细菌菌门结果进行比较。用SPSS
计算皮尔逊相关系数，如表2-5，
各因素的影响
将实验结果用正交设计助手软件进行方差分析，得到各因素极差值，如图2-2所示，极差愈大，所对应的因素愈重要，对实验结果的影响越大。结果表明，培养基中因素对菌门影响大小排列如下:胰酶>果胶>葡萄糖>胆盐>淀粉>无机盐>粘液素。可见对菌门的影响，胰酶是主要因素，无机盐和粘液素是次要因素。
参考文献
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